脊髓性肌（jī）萎缩（suō）症（zhèng）（spinalmuscularatrophy，SMA）是一种常（cháng）染色体隐性遗传病，居儿童致死性（xìng）常染色体隐性遗（yí）传（chuán）病的第2位。位于染色体5q11.2～q13.3上的（de）运（yùn）动神经（jīng）元存活基因（yīn）（Survivalmotorneuron，SMN）是（shì）SMA的主（zhǔ）要致（zhì）病（bìng）基因。

　　人基因组有两个紧邻的高度同源的SMN基因：端粒侧的SMN1和着丝粒侧的SMN2，两者仅有5个碱基（jī）不同。SMN1是（shì）主要功能基因，该基（jī）因突（tū）变可导致SMA发病，SMN2为临床表型的调节基因，影响病情的严重程（chéng）度，其拷贝数增加可减（jiǎn）轻SMA表型。目前已知约94％的SMA患者为SMN1基（jī）因第（dì）7和（或）第8外显子纯合缺失（shī）所致，少数病（bìng）例（lì）可由（yóu）SMN1基因（yīn）点突变或小（xiǎo）的缺失引起。

　　SMN1基因外显子缺失（shī）检测（cè）的意义

　　SMA在人群中的发病（bìng）率为1/5000～1/10000，群体携带者频（pín）率为1/35～1/50，是（shì）出（chū）生缺陷的高危（wēi）因（yīn）素（sù），因此极有必要进行（háng）SMA携带（dài）者的人（rén）群筛查，并通过产前诊断技术降低人（rén）群中SMA患儿（ér）的出生率（lǜ）。

　　临床上将SMA分为（wéi）Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即婴儿型、中间型（xíng）和少年型，严重程度依次递减。神经专科医生一般根据患者发（fā）病年龄、临（lín）床表现及病情进展程度（dù）进行临床诊断，辅（fǔ）助检查方法包括肌电图、肌酶和肌肉活检（jiǎn），结合家族（zú）史和SMN1基（jī）因分析可（kě）进行确诊。由（yóu）于（yú）SMA患儿中约94%为SMN1基因外（wài）显子（zǐ）纯合缺失，因此（cǐ），SMN1基因缺（quē）失检测（cè）对于SMA的诊断具有更高的灵敏度（dù）和（hé）特（tè）异性。且对不同型的SMA患者，SMN1纯合缺失率没有显著差（chà）异，所以，SMN1纯合（hé）缺失（shī）的检测对于不同（tóng）型SMA患者具有相同的临（lín）床诊（zhěn）断（duàn）价值。在（zài）欧美人（rén）群中，SMN1基（jī）因（yīn）纯合缺失检测已成为诊（zhěn）断（duàn）和排（pái）除诊断SMA的首（shǒu）选方法。

　　SMN1基因缺失（shī）检测试剂的现状

　　目前，SMN1基（jī）因外显子（zǐ）缺（quē）失检测试剂较为（wéi）缺乏，临床（chuáng）检验实（shí）验室较为公认的方法是PCR结合限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法（fǎ）。但该方（fāng）法操作较为繁琐，且（qiě）重复性差，不（bú）利于标（biāo）准化，不（bú）易推广（guǎng）。同时，这种方法只能检测出纯合缺失，无（wú）法确认杂合缺失。

　　荷兰的SMAMLPA检测试剂（jì）可对待测靶序列进行半定（dìng）量分析，因此（cǐ）既可检测纯合缺失，亦可确认杂合缺失。在（zài）国内外已有多篇文（wén）献报道（dào）采用该方法进行SMA患者（zhě）诊断和SMA携带（dài）者筛查（chá）。但该（gāi）产（chǎn）品目前仍为“仅用于研究（jiū）”的试剂，尚（shàng）未按照体外（wài）诊（zhěn）断（duàn）类医疗器（qì）械上市（98/79/EC）。

　　2015年底（dǐ），原国（guó）家食品（pǐn）药品监管总局批准了第一项SMN1缺（quē）失突变（biàn）检测试（shì）剂上市（shì）。该（gāi）产品采用多重（chóng）实时荧光（guāng）MGB-TaqMan探针PCR法，以人基（jī）因组（zǔ）单拷（kǎo）贝基因（yīn）RPP40为内参基因，对SMN1基因第7外显子和第8外显子拷贝数进行相对定量检（jiǎn）测，用于SMA患者的（de）体外辅助（zhù）分子（zǐ）诊断。SMN1基因外显（xiǎn）子缺失检（jiǎn）测的难点之一在于排除高同源性（xìng）基因SMN2的干扰（rǎo），特别是对于SMN2高拷贝数的受试者，需（xū）保证结（jié）果的准确（què）可靠。该产品通过对实时荧光PCR相对定量、绝对定量技术进行系统整合（hé），并在反应体系中（zhōng）加入特定（dìng）化学（xué）组分，以抑制PCR引（yǐn）物3’端的胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）的错配，增加PCR扩增的特异性，从而有效控制（zhì）SMN2基因非特异性扩增对检测结果的影响，准确检出（chū）高（gāo）拷贝数（shù）SMN2样本（běn）中SMN1基（jī）因第7和第8外显（xiǎn）子的缺失情况。

　　鉴于（yú）国内外尚无任何按照体外诊（zhěn）断（duàn）试（shì）剂批准上市的SMA分子诊断产（chǎn）品（pǐn），因此临床试（shì）验方（fāng）案中依据EMQN关于《SMA分（fèn）子诊断最佳实践指南（nán）》，采用了（le）国内外SMA体外辅助分子诊断领域公认（rèn）的PCR-RFLP法作为对照（zhào）方法。临床试验共完成1069例，其中正常对（duì）照组777例，SMA病例组292例，统计分析（xī）结果显示申报产品与对（duì）比方法检测结果的一致性为100%（95%置信（xìn）区间（jiān）：99.66%～100%）。此外，9747例正常成年（nián）人大样本中目标（biāo）外显子△△Ct分布范（fàn）围的调查（chá）亦（yì）显示，该产品（pǐn）的纯（chún）合突变判断界值设置合理。

　　该试（shì）剂目前批准的预期（qī）用途（tú）仅包（bāo）含（hán）纯（chún）合（hé）缺失的检测（cè），尚（shàng）不能用于（yú）杂（zá）合缺失（shī）的检测（cè），因此无法用于SMA携带者的筛查，这是该产品的缺陷之一。

　　事实上，该产品在设计上已考虑到SMA携（xié）带者的检测，其检测原理是以待测样本中目（mù）标（biāo）外显子荧光信号Ct值与（yǔ）内（nèi）参基因荧光信号Ct值（zhí）之差（△Ct_s），与正常对（duì）照品（pǐn）三（sān）个梯度稀（xī）释品中（zhōng）目标外显子荧光信（xìn）号Ct值和（hé）内参基因荧光信号Ct值之差的平均（jun1）值（△Ct_a）之差（chà），即（jí）△△Ct，作（zuò）为待测（cè）样本中目标外显（xiǎn）子（zǐ）拷贝数检测变量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据（jù）实时荧（yíng）光定（dìng）量PCR相对定量的基本数学（xué）原理推导得到申报产（chǎn）品检（jiǎn）测变量（liàng）△△Ct的（de）计算公（gōng）式，依据（jù）这一计算公（gōng）式（shì）可推导出纯合缺失、杂合缺失（shī）和（hé）野生型的（de）△△Ct理论值（或（huò）范围）；再结合目标外显子与内参基因扩增效（xiào）率差异以（yǐ）及SMN2不（bú）同拷（kǎo）贝数的影响（xiǎng），可对上述△△Ct理（lǐ）论值进行优化。结果显（xiǎn）示纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct值（zhí）（或范围）之（zhī）间可设置（zhì）合理的判（pàn）断界值，因此理论上该产品可（kě）分别检测（cè）出三种基因（yīn）状态。但鉴（jiàn）于生产企业对杂合缺失与野生型之间的判断界值研究尚不透彻，再加上（shàng）缺乏可判定杂合缺失的对比方法等其（qí）他困难（nán），本次注册申请的预期（qī）用途仅限于（yú）检测纯（chún）合突变，即SMA患者辅助诊断。

　　综上，SMN1基因外显（xiǎn）子缺失检测（cè）在SMA疾（jí）病（bìng）诊断和SMA携带（dài）者筛查中具（jù）有重要（yào）的临床价值。然而（ér）到目前为止，受到（dào）技术（shù）水平的限制，相（xiàng）关的体外诊断（duàn）试剂比较（jiào）缺（quē）乏，特别（bié）是可用于（yú）SMA携（xié）带者（zhě）筛查的杂合缺失检测，尚无适合的（de）体外（wài）诊断试剂上市。（器审中心审评六部  何静云）

来源：中国医（yī）药报